GMP實驗室工程理化分析方法驗證和確認

（1）適用范圍

以下內容適用于化學制品、生物制品（包括物料和產品）的理化分析方法。

（2）哪些分析方法需要驗證和確認?

原則上各類方法均需進行驗證，依照方法來源和適用范圍的不同，驗證的要求有所不同。標準方法通常認為在被確定為標準方法前已經過驗證，使用者在首次采用此類方法前只需進行確認來證明實際使用條件下方法的適用性。

需要進行驗證或確認的分析方法包括:鑒別，雜質定量以及限度測試，物料和產品有效成分含量測定，制劑中其他成分（如防腐劑等，添加劑等）的定量測試，溶出度，釋放度的溶出量測試。此外一些物理參數的測試（例如粒徑分布、旋光度等)方法也需要進行適當程度的驗證。

（3）方法驗證性能參數的選擇

方法驗證參數的選擇應基于方法類型和實際應用環境，并非總要對所有的分析性能參數進行驗證。

（4）方法確認性能參數的選擇

分析方法確認是指已經驗證過的方法在實際使用條件下的適用性的確認試驗。對于實驗室基本的、已成為日常操作的法定測試方法不需要進行確認，除非有現象表明法定測試方法不適用于被測的物質。

不同的監管機構對于方法確認的技術要求略有差別,使用者應針對不同監管機構的技術要求，通過對分析方法類別、產品屬性以及方法使用過程中可能出現的風險的定義和識別來選擇方法確認活動的具體驗證參數，不限制對參數的適當的加嚴或放寬。

（5）性能參數的驗證

方法驗證試驗中各個參數的測試順序沒有官方的指南，優選順序取決于方法本身。建議耗時很長或者需要替換試驗條件的參數測試一般放在后面執行，如方法耐用性。適用時某些參數可以合并在一起試驗，如精密度和準確度測試。

①專屬性    專屬性定義為“當預料到一些組分可能存在時，準確無誤地檢測被分析物的能力。通常這些可能存在的組分有雜質、降解產物、基質等”。專屬性的研究一般優先于其他驗證項目，為方法首要的屬性,鑒別反應、雜質檢查、含量測定方法應考察其專屬性。一種方法不夠專屬，可由其他分析方法予以補充。

a.鑒別    鑒別試驗應證明被分析物符合其特征，專屬性試驗要求證明能與可能共存的物質或結構相似化合物區分，通常通過含被分析物的樣品呈正反應，而不含被分析物的樣品呈負反應，結構相似或組分中的有關化合物也應呈負反應的途徑來證明。

b.雜質檢查    在可獲得雜質情況下，可向供試品中加入一定量的雜質，證明雜質與共存物質能得到分離和檢出。在不能獲得雜質或降解產物情況下，專屬性可通過與另一種已證明合理但分離或檢測原理不同，或具較強分辨能力的方法進行結果比較來確定。或將供試品用強光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解及氧化的方法進行破壞，比較破壞前后檢出的雜質個數和量。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測。

c.含量測定    在可獲得雜質情況下，對于主成分含量測定可在供試品中加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并與未加雜質和輔料的試樣比較測定結果。

在不能獲得雜質情況下，可采用另一個經驗證方法進行比較，對比兩種方法測定的結果。也可采用破壞性試驗[強光照射、高溫、高濕、酸（堿)水解及氧化]，得到含有雜質或降解產物的試樣，用兩種方法進行含量測定比較測定結果。必要時進行色譜峰純度檢查，證明含量測定成分的譜峰中不包含其他成分。

②精密度    精密度系指在規定的條件下，同一份均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

精密度可以在以下三個層面考慮:重復性、中間精密度和重現性。在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性;在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定所得結果之間的精密度，稱為中間精密度;在不同實驗室由不同分析人員測定所得結果之間的精密度，稱為重現性。

a.重復性    在進行重復性驗證時，要求待測組分濃度在100%時重復測量至少6次或覆蓋整個規定濃度范圍并重復測量至少9次。例如，可以在三個不同濃度分別進樣三次。

b.中間精密度    中間精密度通過比較同一實驗室數日內各次檢測的結果計算而得。方法的中間精密度可以反映以下因素引起的結果差異:不同的操作人員;不一致的操作時間;不同的儀器;不同供應商的標準品和試劑;不同批次的色譜柱;綜合因素。

中間精密度驗證的目的是證實方法在同一個實驗室內運行能夠得到相同的結果。

c.重現性    重現性的目的是證實分析方法在不同實驗室運行能夠得到相同的結果。分析方法的重現性是通過不同實驗室的不同分析人員對均勻樣品分析的結果計算而得的。重現性的驗證對于在不同實驗室使用的方法來說非常重要。

d.精密度數據要求    精密度驗證均應報告偏差、標準偏差、相對標準偏差或置信區間。在基質復雜、含量低干0.01%及多成分等分析中，精密度接受范圍可適當放寬。

③準確度    準確度足義為測定值與真實值或認可的參考值之間接近的程度。準確度也可以定義為方法的測定值與真實值接近的程度。

準確度為定量測定的必要條件，因此涉及定量測定的檢測項目均需要驗證準確度，如含量測定、雜質定量試驗等。準確度試驗濃度應能覆蓋整個考慮范圍，并且應包含接近定量限的濃度點，濃度范圍的中間值,還有校正曲線的最高點。

a.含量測定

制劑可用含已知量被測物的各組分混合物進行測定。如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物講行測定，必要時，與另一個已建立準確度的方法比較結果。中凈環球凈化可提供無塵車間、潔凈車間、凈化車間的咨詢、規劃、設計、施工、安裝改造等配套服務。

b.雜質定量試驗    雜質的定量試驗可向制劑中加入已知量雜質進行測定。如果不能得到雜質，可用本法測定結果與另一成孰的方法進行比較，如經過驗證的方法。

如不能測得雜質的相對響應因子，可在線測定雜質的相關數據，如采用二極管陣列檢測器測定紫外光譜，當雜質的光譜與主成分的光譜相似，則可采用原料制品的響應因子近似計算雜質含量（自身對照法）。并應明確單個雜質和雜質總量相當于主成分的質量比(%)或是面積比(%)。

c.化學成分測定方法的準確度    可用對照品進行加樣回收率測定,即向已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品計算回收率。在加樣回收試驗中需注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和須在標準曲線線性范圍之內。

d.校正因子的準確度    本文中的校正因子是指氣相色譜法和高效液相色譜法中的相對重量校正因子。絕對（或定量）校正因子是指單位面積的色譜峰代表的待測物質的量,待測定物質與所選定的參照物質的絕對校正因子之比,即為相對校正因子。

相對校正因子可采用替代物（對照品）和被替代物（待測物）標準曲線斜率比值進行比較獲得;采用紫外吸收檢測器時，可將替代物（對照品）和被替代物（待測物）在規定波長和溶劑條件下的吸收系數比值進行比較，計算獲得。

e.準確度數據要求    在規定范圍內,取同一濃度（相當于100%濃度水平）的供試品，至少測定6份樣品的結果進行評價;或設計3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液，用9份樣品的測定結果進行評價。化學制品應報告已知加入量的回收率（%)，或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或置信區間（置信度一般為95%)；制品應報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結果和回收率（%）計算值，以及回收率（%）的相對標準偏差（RSD)或置信區間。校正因子應報告測定方法、測定結果和RSD。

④線性    線性系指在設計的范圍內，測定響應值與試樣中被測物濃度呈比例關系的程度。

線性可以直接用待測物質測定（通過稀釋標準貯備液）或分別稱取待測品種的各組分后合成混合物。配制5個以上不同濃度的標準溶液（濃度范圍至少在期望濃度的80%～120%之間)，用試驗結果計算線性。響應值應與被分析物的濃度成直接的比例關系，或通過定義明確的數學計算形成比例關系。用于結果計算的線性回歸方程其截距不得明顯偏離零點。如果得到一個顯著的非零截距,應證明其對方法準確度無影響。

應報告線性曲線的相關系數、y軸截距、回歸線斜率和殘差平方和。報告中還應包括數據圖。

⑤范圍     范圍系指分析方法能達到一定精密度、準確度和線性要求時的高低限濃度或量的區間。分析方法的范圍一般用與檢測結果相同的單位表述（例如，百分比)。對于含量測定，要求的小范圍是檢測濃度的80%～120%。雜質的范圍擴展為定量限到每種雜質規定限度的120%,或雜質規定限度的50%～120%。

⑥檢測限和定量限  

檢測限常常與方法的靈敏度相混淆，靈敏度是以響應值對被分析物的濃度或質量作圖所得校正曲線的斜率。

定量限和檢測限測定方式列舉如下。

a.視覺判斷    通過測定待測成分濃度已知的樣品，并確定該成分能被可靠檢出的低水平來計算檢測限。

b.信噪比法    通過比較測得的已知低濃度的樣品信號和空白樣品的信號，建立能夠監測的被測物的低濃度所得到的方法。

c.基于空白的響應值標準偏差    通過分析適當數量的空白樣品并計算所得響應值的標準偏差來測量分析背景響應值的大小。

檢測限數據須用含量相近的樣品進行驗證。應附測定圖譜，說明試驗過程和檢測限結果;定量限數據還應包括準確度和精密度驗證數據。

⑦耐用性    耐用性系指在測定條件有小的變動時,測定結果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于日常檢驗提供依據。

確定方法的耐用性時，使一系列的方法參數在一定的范圍內變動，測定這些變動對結果的量化影響。如果參數的影響在預先設定的允許范圍內,則證實方法在該參數范圍內耐用。

耐用性試驗可以確定分析方法的關鍵參數及其允許的容量范圍，并可以幫助評估一種或某種參數變化后方法是否需要重新驗證。在方法開發階段應考慮通過評估的方式確定耐用性試驗因素設計，這也是“質量源于設計”（QbD)在方法開發中的體現。

⑧穩定性    穩定性試驗對于計算從樣品采集到樣品分析之間的允許時間非常重要，避免在制備樣品溶液、提取、凈化、相轉移或樣品瓶的貯存（在冰箱或在自動進樣器里）過程中化學化合物在分析前發生降解。

用于穩定性試驗的條件應反映實際樣品在處理、貯存和分析時遇到的各種情況。通過比較放置周期內的溶液與新鮮制備溶液的儀器響應值來檢測穩定性，通過樣品溶液的重復測試,計算測得值的RSD來確定溶液穩定性。

（6）分析方法日常質量控制計劃的制定

分析方法驗證的目的不僅是在開始使用方法時保證分析數據的有效性，還要在方法的整個使用周期內都確保其有效性。為了證實方法和系統的性能在樣品分析時與開始規定的相同,應在常規的樣品分析中納入適當的檢查手段。

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